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技術應用
【摘要】表面等離子體共振(SPR)技術作為一種強大的生物物理工具，在分子垂釣領域展現(xiàn)出 卓越的應用價值。分子垂釣是藥物研發(fā)的前沿技術，在藥物發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮著重要作用，該技術憑借其 高靈敏度、高特異性、實時活性監(jiān)測、自動化進樣和回收能力，結合高分辨質譜的鑒定功能，不僅 可以用于從細胞裂解液中篩選和捕獲蛋白質等生物大分子，還能應用于中藥和天然產(chǎn)物提取液中小 分子化合物的垂釣。在復雜的粗樣本原液中特異性的垂釣發(fā)掘出高價值的分子和活性成分的獨特能 力使得分子垂釣技術成為現(xiàn)代生物醫(yī)藥和食品行業(yè)中備受關注的技術。本文詳細闡述了基于 SPR 的 分子垂釣技術原理，全面綜述了其在藥物研發(fā)、生物醫(yī)學研究、中藥成分篩選及作用機制探究等多 個領域的應用情況，深入探討了實驗中的關鍵因素，并對該技術面臨的挑戰(zhàn)與未來發(fā)展趨勢進行了 展望。
1、引言
隨著生命科學與生物技術的迅猛發(fā)展，深入了解分子間相互作用機制對于諸多領域的突破至關 重要。SPR 技術憑借其能夠實時、無標記且高靈敏地監(jiān)測分子間結合與解離過程的特性，成為分子 垂釣的得力手段，為解決復雜的生物學和藥學問題提供了新途徑。分子垂釣是藥物研發(fā)的前沿技 術，被廣泛應用于新目標和活性成分的檢測，在藥物發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮著重要作用，具體的作用包括發(fā)現(xiàn) 未知的新靶點和識別藥物已知的作用位點。此外，當天然產(chǎn)物的目標難以確定時，分子垂釣技術可 以識別其有效的單體組分。分子垂釣技術通過直接篩選細胞提取物來尋找和識別可能與誘餌配體相 互作用的分子，為藥物靶點發(fā)現(xiàn)的研究奠定了良好的基礎。
2、基于 SPR 的分子垂釣技術原理
SPR 現(xiàn)象基于金屬薄膜表面等離子體與入射光的共振耦合，當入射光特定角度照射到鍍有金屬 膜(如金膜)的傳感芯片表面，且表面附近介質折射率發(fā)生變化時，會引發(fā)反射光強度的急劇改 變，通過監(jiān)測這一變化可實時追蹤分子結合與解離動態(tài)。基于 SPR 的分子垂釣技術基本原理就是從 中藥煎劑、中草藥提取物或化合物庫等復雜混合物中“釣取”可以與配體結合的分子。在分子垂釣 應用中，將靶標分子(如蛋白質、核酸等)固定于芯片表面，注入含待檢測分子的樣品溶液，若兩者發(fā)生特異性結合，芯片表面折射率改變，SPR 信號響應，垂釣出混合樣品中與靶蛋白結合的分子，
最后利用質譜對回收到的樣品進行鑒定[1]。在這些研究中使用 SPR 生物傳感器，可以解決以下任務: (a)基于 SPR 選擇特定生物樣品最有效親和分離所需的固定化條件;(b)基于 SPR 的分子垂 釣，用于隨后通過質譜進行蛋白質鑒定;(c)基于 SPR 驗證已鑒定蛋白質與固定化配體的相互作 用。
3、基于 SPR 的分子垂釣應用領域
3.1 藥物研發(fā)
SPR 技術可快速篩選大量化合物與潛在靶點蛋白的相互作用。例如，在抗癌藥物研發(fā)中，將癌 相關蛋白固定于芯片，與小分子化合物庫進行垂釣實驗，能精準定位可抑制該蛋白活性的先導化合 物，測定先導化合物與靶點的親和力常數(shù)(KD)、結合速率常數(shù)(ka)和解離速率常數(shù)(kd)等動 力學參數(shù)，直觀反映結合的緊密程度與穩(wěn)定性。通過不斷調整化合物結構并重復垂釣測試，篩選出 親和力更強、藥代動力學性質更佳的候選藥物，提高藥物研發(fā)成功率,進而確定全新的藥物靶點，為 后續(xù)藥物設計開辟方向[2,3]。如中國科學院上海有機化學研究所生物與化學交叉學科研究中心團隊[4] 預測 STAT3 為雷帕霉素的直接功能性蛋白質靶標，通過分子垂釣確認該假設，并發(fā)現(xiàn)雷帕霉素同時 降低 STAT3 和 c-myc 的表達，還在肝細胞癌的異種移植小鼠模型中驗證了結論，為癌癥治療的 STAT3 抑制劑的藥理學和藥物開發(fā)提供重要信息。暨南大學醫(yī)學院費嘉教授團隊[5]通過 SPR-MS 技術鑒定小 檗堿作用靶點 UHRF1，將小檗堿固定到傳感芯片上，加入細胞裂解液孵育，垂釣靶蛋白并回收，經(jīng)質 譜鑒定，確定 UHRF1 為小檗堿的潛在作用靶點，并通過 SPR 和分子對接驗證了相互作用。
Patching SG[6]研究了 SPR 技術在 G 蛋白偶聯(lián)受體配體篩選中的應用，通過分子垂釣篩選出與特定 G 蛋白偶聯(lián)受體具有高親和力的配體分子，為開發(fā)針對該類受體的藥物提供了重要的篩選工具。上海 第二軍醫(yī)大學藥學院 Cao Y 等[7]描述了一種基于 SPR 的靈敏、高效、便捷的方法的建立和應用，用于 從中草藥中篩選靶向腫瘤壞死因子受體 1 型(TNF-R1)的活性成分。調整中草藥提取物濃度進行 SPR 結合試驗，在大黃提取物中觀察到顯著的響應信號。然后，回收、富集 TNF-R1 結合成分，并 通過 UPLC-QTOF/MS 進行分析,鑒定出 hyscon-8-O-β-D - 單葡萄糖苷(PMG)為生物活性化合物， 并通過 SPR 親和力分析確定 PMG 對 TNF-R1 的親和力常數(shù)。
3.2 生物醫(yī)學研究
研究細胞內信號傳導通路時，依次固定不同的信號蛋白，垂釣與之相互作用的上下游蛋白，逐步勾
勒出復雜的蛋白質相互作用網(wǎng)絡，助力揭示細胞生理功能調控機制以及疾病發(fā)生發(fā)展的分子基礎 Alexis S,Ivanov 等人[8]使用了結合親和分子垂釣和后續(xù)質譜的方法，研究了與固定化微粒體細胞色 素 b5(CYB5A)相互作用的人類肝臟蛋白質，結果表明直接分子垂釣適用于分析正常和病理條件下 的蛋白質 - 蛋白質相互作用，這對醫(yī)療領域中研究疾病狀態(tài)下的蛋白質相互作用具有重要意義。石 河子大學新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室的研究團隊選擇 TNF-α為靶點，利用 TNF-α 芯 片，“垂釣” 中草藥提取物中的活性分子，并用 LC-MS 進行鑒定得到 3 種活性分子，隨后測定了 三種活性分子與靶點 TNF-α 的親和力，明確其結合能力，最終在細胞水平證明其 TNF-α 抑制劑 的作用。
針對特定疾病，將疑似生物標志物分子(如特定蛋白或核酸片段)固定于芯片，從患者血液、
腦脊液等生物樣本中垂釣與之結合的內源性分子，經(jīng)鑒定后發(fā)現(xiàn)新的生物標志物，用于疾病早期診
斷、病情監(jiān)測及預后判斷。Savitha,K [9]使用 SPR 技術對乳腺癌進行早期檢測。模擬結果顯示正常細胞和 癌細胞的波長光譜發(fā)生明顯變化，這種基于 SPR 的傳感器非常靈敏，是生物醫(yī)學應用的最佳選擇。Huimin
Lei[10]在霍奇金淋巴瘤(HL)的研究中，構建了一系列網(wǎng)絡模型，包括背景網(wǎng)絡、HL 基本網(wǎng)絡和特定于 HL 的網(wǎng)絡。通過分析這些網(wǎng)絡，研究了 HL 相關蛋白的連接特性。發(fā)現(xiàn) HL 相關蛋白質更可能彼此連接，并且作 為 HL 特定網(wǎng)絡的骨干，可以進一步將 HL 特定網(wǎng)絡分為五個子網(wǎng)和 49 個蛋白質，它們可能與 HL 密切相關。 此外，還發(fā)現(xiàn)蛋白質對的共調度是 HL 特定網(wǎng)絡中蛋白質網(wǎng)絡上 miRNA 的主要調節(jié)模式。根據(jù) miRNA 對蛋 白質網(wǎng)絡的調節(jié)，鑒定出 5 個核心 miRNA 為潛在的 HL 診斷生物標志物。
3.3 中藥研究
鑒于中藥成分復雜多樣，SPR 技術提供了高效篩選途徑。以某單味中藥或復方提取物為樣品， 針對特定病癥相關靶標(如炎癥相關細胞因子受體)進行垂釣，結合質譜等技術可快速鎖定具有活 性的小分子成分，如從清熱解毒類中藥中垂釣出黃酮類、萜類等抗炎活性成分。
海軍醫(yī)科大學藥學院藥物代謝產(chǎn)物研究上海重點實驗室 Zhang Y 等[11]構建了基于表面等離子共 振技術(SPR)的雙靶點中草藥分析體系，將 Spike RBD 蛋白和 ACE2 蛋白分別偶聯(lián)在芯片的不同 通道上，“垂釣”出中草藥提取物中的活性分子，發(fā)現(xiàn)葛根素與 Spike RBD 蛋白、ACE2 蛋白都能 特異性結合。為探索中草藥活性成分的靶向疾病治療機制提供了一種新思路。
福建省片仔癀天然醫(yī)藥研發(fā)企業(yè)重點實驗室聯(lián)合福建中醫(yī)藥大學[12]建立了一種基于 SPR 垂釣技
術來分析安宮牛黃丸的質量標志物的方法，利用 UPLC-Q-TOF-MS 分析安宮牛黃丸主要化學成分，采 用網(wǎng)絡藥理學預測潛在靶點，構建 STAT3 蛋白芯片進行垂釣回收，分析鑒定出 10 種潛在的活性成 分，并確定了其對 STAT3 靶點的親和動力學參數(shù)。海軍軍醫(yī)大學團隊[13]，將攜帶膜蛋白 CXCR4 的 慢病毒顆粒固定在 CM5 芯片上，對川芎、穿心蓮、苦楝子的草藥提取物進行 SPR 分子垂釣，串聯(lián) UPLC-QTOF-MS 技術，鑒定到來源于川芎的洋川芎內酯 I，并證明其與 CXCR4 蛋白的相互作用。第 二軍醫(yī)大學聯(lián)合上海大學團隊[14]，分別將 TNF-R1、TNF-α 偶聯(lián)到 CM5 芯片上，表征芯片活性和特 異性后，將白芍提取物按照不同比例稀釋后進樣，垂釣回收與 TNF-R1 結合的成分，再通過 UPLC- QTOF/MS 分析鑒定，最后用 SPR 技術進一步確認芍藥苷和丹皮酚與 TNF-R1 的相互作用。
確定中藥活性成分后，進一步利用 SPR 精確測定其與靶標的親和力、結合位點等細節(jié)，結合細 胞實驗和動物模型，深入解析中藥成分如何通過干預靶標分子發(fā)揮藥效，揭開中藥傳統(tǒng)理論的現(xiàn)代 科學內涵，推動中藥現(xiàn)代化進程。
4、基于 SPR 的分子垂釣實驗關鍵因素
4.1 靶標分子的選擇與固定
依據(jù)研究目的，優(yōu)先選擇與疾病緊密關聯(lián)、功能明確且具有可成藥性的分子作為靶標。例如在 腫瘤研究中，常聚焦于癌基因產(chǎn)物、腫瘤抑制因子等;在抗感染研究中，則選取病原體關鍵入侵蛋 白或宿主免疫相關受體?；瘜W偶聯(lián)法可實現(xiàn)牢固結合，常用 NHS/EDC 等試劑，不過操作需精細控制 避免影響靶標活性，需根據(jù)靶標特性靈活抉擇。
4.2 樣品制備與處理
高純度樣品能減少非特異性吸附干擾，提高信號的準確性。對于生物樣本，需通過超濾、色譜 等技術去除雜蛋白、核酸等雜質;對于化學合成樣品，要嚴格控制合成副產(chǎn)物含量。同時緩沖液的 pH 值、離子強度、滲透壓等參數(shù)對分子間相互作用也影響顯著。合適的緩沖液應模擬生理環(huán)境，維 持靶標與待測分子的活性，同時避免促進非特異性結合，通常需經(jīng)過預實驗優(yōu)化篩選。
4.3 實驗設計與數(shù)據(jù)分析
設立陰性對照(如僅固定基質無靶標分子)和陽性對照(已知強結合物與靶標組合)，有效甄別假陽性與假陰性結果，確保實驗數(shù)據(jù)的可靠性。然后依據(jù) SPR 儀器輸出的傳感圖，運用專
業(yè)軟件(如 SPR Analysis )擬合曲線，準確計算動力學參數(shù)、親和力數(shù)據(jù)，結合統(tǒng)計學方法深入挖 掘數(shù)據(jù)背后的生物學意義。
5、基于 SPR 的分子垂釣的優(yōu)勢與局限性
5.1 SPR 技術在分子垂釣中的優(yōu)勢
5.1.1 高效性:表面等離子體共振(SPR)生物傳感器是一種高效的儀器，適用于分子相互作用 的直接實時配準，而無需額外使用任何標簽或偶聯(lián)方法[11]，可以快速、準確地檢測分子間的相互作 用，提高了分析的效率。例如，在研究復雜生物系統(tǒng)中分子間相互作用時，SPR 生物傳感器能夠快 速篩選出潛在的相互作用分子，為后續(xù)的研究提供了有力的支持。
5.1.2 特異性強:SPR 技術在分析各種配體受體相互作用時特別有效。這是因為 SPR 生物傳感 器能夠檢測到分子間的特異性結合，從而排除非特異性結合的干擾。例如，在蛋白質相互作用的研 究中，SPR 技術可以準確地檢測到特定蛋白質之間的相互作用，為研究蛋白質的功能提供了重要的 依據(jù)。
5.1.3 微量檢測:SPR 技術具有微量檢測的優(yōu)點，能夠檢測到極少量的生物分子[12]。這對于研究 生物體內微量的生物分子相互作用具有重要的意義。例如，在研究細胞信號傳導、受體-配體、抗 體-抗原分子垂釣等生命科學領域時，SPR 技術可以檢測到微量的生物分子，為研究這些領域提供了 有力的工具。
5.1.4 實時監(jiān)測:SPR 技術能夠實時監(jiān)測分子間的相互作用，為研究分子間的動態(tài)變化提供了有 力的支持[11]。例如，在研究蛋白質相互作用的動力學過程中，SPR 技術可以實時監(jiān)測蛋白質之間的 結合和解離過程，為研究蛋白質的功能提供了重要的依據(jù)。
5.1.5 適用性廣:SPR 技術已被廣泛應用于蛋白質組學、細胞信號傳導、受體-配體、抗體-抗原 分子垂釣、免疫識別、癌癥研究和新藥篩選等生命科學領域。這表明 SPR 技術具有廣泛的適用性， 可以應用于不同的研究領域。例如，在海洋糖類物質的活性研究中，SPR 技術已成功用于海洋糖類 化合物作用靶點確定、親和力測定及糖類抗體研究等方面[13]。
5.2 SPR 技術在分子垂釣中的局限性
5.2.1 復雜樣品分析困境:面對生物體內高度復雜的樣本(如全血、組織勻漿)，非特異性吸附嚴重，信號易受干擾，精準識別特異性結合信號難度大增。
5.2.2 通量瓶頸:傳統(tǒng) SPR 設備單次檢測樣本量有限，在大規(guī)?；衔锖Y選、多靶標平行研究 場景下效率較低，難以滿足高通量需求。
6、展望
6.1 技術聯(lián)用突破:與微流控技術結合，實現(xiàn)樣品微量化、自動化處理，降低非特異性吸附;與 質譜聯(lián)用，實時鑒定垂釣所得分子，拓展信息獲取維度，提升復雜樣品分析能力。
6.2 高通量設備革新:研發(fā)新一代高通量 SPR 系統(tǒng)，同步檢測多個樣本或靶標，大幅提升通 量，加速藥物研發(fā)與生物標志物發(fā)現(xiàn)進程。
6.3 普及應用推進:通過技術改進、規(guī)?；a(chǎn)降低成本，開發(fā)操作簡易的儀器平臺，配套完善 的培訓服務，促使 SPR 技術在更多領域生根發(fā)芽，助力科研與產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
7、結論
SPR 技術在分子垂釣領域已取得豐碩成果，廣泛滲透至藥物研發(fā)、生物醫(yī)學、中藥研究等核心 陣地，為破解分子相互作用謎題提供關鍵支撐。盡管當前面臨復雜樣品、通量及成本等挑戰(zhàn)，但隨 著技術創(chuàng)新與聯(lián)用策略的深入實施，未來有望迎來新的飛躍，持續(xù)為生命科學前沿探索與應用轉化 注入強大動力。
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